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流式细胞仪检测RNA

PrimeFlow™ RNA 做到了!

     流式细胞术一直以来都是利用各色荧光染料标记的抗体检测蛋白表达。从早期的4-5色标记,到现今可以同时标记达到10多种蛋白,给科学研究者带来更大的方便,找到更多的解答。但也仅局限于蛋白层级的研究。

     流式细胞技术的新应用一直都是大家期盼的,今天Affmetrix-eBioscience开启了流式技术的新局面。PrimeFlow™ RNA实现了利用流式仪来检测RNA的表达,更因流式细胞检测原本就是单细胞检测方法,所以可以体现的不仅仅是蛋白和RNA同时检测,而是更精细地呈现 “单细胞”水平蛋白跟RNA的表达关系, 而且可以做到3种RNA 的同时检测!

     到底这个PrimeFlow™ RNA技术是如何实现的呢?首先要了解的是Branch-DNA(bDNA)放大技术,顾名思义,bDNA是像树枝形态的DNA结构(如图A),这样的树枝结构可以偶联上数百个荧光染料,将信号放大到流式细胞仪可以读取的范围内,所以如果没有这个bDNA帮助放大信号,流式细胞仪是无法检测RNA表达的。
 图A
     bDNA跟RNA之间是借由图A中两个像英文“Z”的ZZ探针跟RNA结合,ZZ的序列跟目标RNA是互补的,利用ZZ探针来捕获目标RNA,接着bDNA放大信号,流式细胞仪就可以检测RNA了!而且因为流式荧光通道很多,所以同一个细胞可以同时检测3种RNA,荧光通道分别是488,647和750。

     既然流式仪本来就是检测蛋白的,当然是要结合蛋白和RNA一起检测,才可以获得更多的信息量。,那要先染RNA再染蛋白还是先染蛋白再染RNA???来看看实验流程图(图B)吧!是先染蛋白后固定破膜再染RNA,放大信号,流式仪分析。实验流程其实就是这麽回事,但大家关注的是如何将该技术应用到自己的课题上吧!

 图B

     目前有那些应用?下面这个应用是想区分两个不同亚型的乙肝病毒株,设计了两种不同的RNA探针,实验结果(图C )清晰地展现出细胞是单独感染了其中一种还是同时被两种病毒株感染,进而再研究这些细胞之间的差异表现。


图C截图来源文章:Affymetrix网站

     再来看看一些已经发表的文章。一个日本的团队把过敏性皮炎病人的细胞取出来后培养在小鼠模型中,先用抗体把人跟鼠的CD4+ T细胞设门圈出来,再用CD45抗体跟B2M mRNA探针(B2M mRNA探针只辨识人的基因)来区分细胞是人源还是鼠源(图D)。然后再具体研究人源细胞表达IL-22的情况,结果发现就是这些细胞会大量表达IL-22从而造成一连串的免疫反应。

 图D 截图来源文章:Mashiko et al., J Allergy Clin Immunol. 2015 Mar 16.

     再来看一个发表在Nature期刊中的例子(图E),也是一个同时检测蛋白和RNA,获取二者动态变化的好例子。CD45阳性细胞设门出来,把IgA和CD19阳性的细胞圈出来,专门研究这些特定的细胞里面表达的IL-10 mRNA跟蛋白的情况,最后发现就是这么一小群特定的B细胞应对免疫疗法是有功能性的。

 图E *PMA/Iono/LPS刺激,小鼠细胞来自前列腺癌症小鼠模型。截图来源文章:Shabnam Shalapour1,2.,Nature Letter

     这仅仅是PrimeFlow™ RNA一小部分的应用,是流式细胞技术跨到RNA检测的第一步,未来是不是有更多的可能方案是很让人期待的!


Affymetrix China

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eBioscienceChina@affymetrix.com


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