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琼脂糖凝胶电泳

发表时间:2019-10-24 00:00

对于分子量大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷。琼脂糖是直链多糖,它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成

琼脂糖与琼脂的区别

琼脂是由琼脂糖(agarose)和琼脂果胶(agaropectin)组成的。琼脂糖的结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖;琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似,但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分,凝胶能力差。 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除,否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团,就会造成电内渗,电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低,通常在0.2%以下,电内渗比较小,通常在0.13%以下。 简言之,琼脂糖是从琼脂中精细提取的,有自身独特的性质,所以琼脂糖要比琼脂贵得多。

琼脂糖凝胶电泳:实验原理

1.DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。

2.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。

3.DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA 分子。

琼脂糖凝胶电泳

1. 根据电泳需要,配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。 注意:用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。

2. 根据制胶量及凝胶浓度,在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中,加入准确称量的琼脂糖粉。 注意:总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。

3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖 注意:必须保证琼脂糖充分完全溶解,否则,会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡,停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。

4.使溶液冷却至60℃左右,如需要可在此时加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml,并充分混匀——不提倡使用。 注意:溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时,请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。

5.将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在5-8 mm 之间。 注意:不要产生气泡,溶液温度太高(>60℃),会使得水分 过分蒸发,改变凝胶离子浓度,影响电泳效果。

6.在室温下使胶凝固(大约30 分钟),然后放置于电泳槽中进行电泳。 注意:凝胶不立即使用时,用保鲜膜将凝胶包好在4℃下保存,或者放在制胶的缓冲液中,一般可保存2~5 天。

琼脂糖凝胶电泳

1 仪 器:水平电泳仪、中低压电泳仪电源、凝胶成像 分析系统 2 配套试剂:

(1)介 质:琼脂糖凝胶

(2)缓冲液:TAE缓冲溶液(Tris碱、乙二胺四乙酸 二钠二水、冰乙酸) TBE缓冲溶液( Tris碱、乙二胺四乙酸 二钠二水、硼酸)

(3)上样缓冲液: 6×DNA Loading Buffer(DNA样 品专用包含:EDTA、甘油、二甲苯青 、溴酚蓝)

(4)染 料: EB\ Gelred \ goldview \ GenGreen \ GenView \SYBRGreen等荧光染料

5 耗材: 灭菌的白枪头、黄枪头、蓝枪头、200ul\500ul\1.5ml离 心管等 6 DNA Marker 根据待测物分子量来定

琼脂糖凝胶电泳缓冲液

有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳 Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液(TAE) Tris-硼酸盐缓冲液(TBE) Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)

琼脂糖凝胶缓冲液

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琼脂糖凝胶缓冲液

三者之中,TAE的缓冲能力最低,双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%,对于高分子量的DNA,TAE的分辨率略高于TBE或TPE,对于低分子质量的DNA,TAE要差些。用于分析复杂基因组的Southern印迹均用TAE电泳缓冲液制备凝胶和电泳。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。

琼脂糖凝胶缓冲液

TBE可以使用2-3次左右,而TAE用1-2次就要更换。电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲性能下降,可能使DNA条带模糊或不规则DNA带迁移。 电泳缓冲液刚好没过凝胶1-2mm为好,太多则电流加大,凝胶发热。

琼脂糖凝胶上样缓冲液

上样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。上样缓冲液有三个作用:

1)增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内;

2)使样品带有颜色,便于上样操作;

3)其中的指示剂在电场中以可以预测的泳动速率 向阳极迁移。 上样缓冲液有几种,但使用的指示剂基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰FF。

琼脂糖凝胶上样缓冲液

溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍,这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关; 在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约300bp的线性双链DNA相同,在0.5%-1.4%浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。 含有的甘油可以加大样品的密度,使其大于TAE的浓度而沉降到点样孔中,防止样品飘出点样孔


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