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影响凝胶聚合的因素

发表时间:2019-10-24 00:00

1) Acr及Bis的纯度:应选用分析纯的Acr及Bis,如试剂不纯,含有杂质或丙烯酸时,则凝胶聚合不均一,或聚合时间延长甚至不聚合, 因而需进一步纯化。 Acr和Bis贮液的pH值为4.9-5.2,当pH值的改变大于0.4pH单位则不能使用,因在偏酸或偏碱的环境中,它们可不断水解放出丙烯酸和NH4+ 而引起pH值改变,从而影响凝胶聚合。 因此,配制的Acr和Bis贮液应置棕色瓶中,4℃贮存 ,存放期一般不超过1-2个月为宜。

2)AP、核黄素、TEMED:增加AP和TEMED可加快聚合速率,但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。

3)pH:碱性条件下聚合快,但碱性过强时胶硬而脆,需高pH时应减少AP和TEMED用量,制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。

4)温度:温度高聚合快,但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡,低温(5℃)聚合凝胶会变得脆而混浊,一般25-35℃聚合较好。

5)氧分子:氧分子阻碍凝胶聚合,故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气,再加引发剂。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAGE应用范围广,可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备,还可测定相对分子质量、等电点等。 聚丙烯酰胺凝胶电泳又有以下几种:

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

连续密度梯度电泳

聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳

聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (DNA序列分析)

1 仪器: PCR扩增仪(96孔)、序列分析电泳槽:DYCZ-20C\DYCZ-20G、高压电源:DYY-10C或DYY-12型 水平摇床(WD-9405D)、电子天平 (精确1毫克) 、移液枪:WD-2108 、双显磁力搅拌器、高压蒸汽灭菌锅、pH计、水浴锅、高速台式冷冻离心机、微型离心机:WD-2105A/B等

2 实验试剂: 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、Tris碱、10×Buffer、 dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、去离子甲酰胺、溴酚蓝 、 二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、硼酸、尿素、 亲和硅烷、剥离硅烷、四甲基乙二胺、过硫酸铵、硝酸银 、DNA Marker(根据PCR片段大小选择合适的Marker范围, 如SSR实验的范围在100bp—400bp之间)

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聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶 所谓非变性凝胶,即在凝胶中不加SDS和巯基乙醇等变性剂,这种凝胶中,蛋白质仍保持活性,其迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的,常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。 所谓变性凝胶,即在凝胶中加入变性剂,如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构,把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。


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